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Otimização Da Extração De DNA De Amostras Urinárias Humanas Para Perfilamento Da Comunidade De Micobiomas PLOS ONE

March 2024 Off



Paralelamente à curva padrão, foi realizado um qPCR em tempo real em duplicata para cada um dos extratos de DNA quadruplicados (não diluídos) obtidos com os kits Qm, Qv e iG. Em terceiro lugar, além do protocolo de extração utilizado para obter um rendimento satisfatório de DNA humano, também o tempo de amostragem é um aspecto importante para a pesquisa em saúde pública. Na literatura, a maioria dos estudos é realizada na primeira urina da manhã, pois é relatado que ela está mais concentrada nas células.23 Porém, na prática, para estudos relacionados à saúde pública, a primeira urina da manhã nem sempre está facilmente disponível.

  • As amostras utilizadas como corpos de prova ao longo deste artigo foram anuladas.
  • Para análise qualitativa do cfDNA também é importante utilizar um protocolo de centrifugação adequado para evitar a contaminação por gDNA derivado de células na urina.
  • Para o processamento de um grande número de amostras, os kits comerciais são muito convenientes pelo seu protocolo padronizado e que economiza tempo.
  • Requerem um protocolo rápido, fácil e padronizado.
  • Ácidos nucleicos e/ou primers oligonucleotídicos e podem levar à falha da PCR.19–21 Portanto, para realizar ensaios baseados em PCR para medir biomarcadores de DNA em amostras de urina, os inibidores de PCR devem ser inativados ou removidos durante o procedimento de extração.


Para remover essas células da amostra antes do isolamento do cfDNA ao estudar amostras de urina fresca, é necessário um passo curto e de baixa velocidade (Fig. 8). Infelizmente, estes protocolos de baixa velocidade não limpam todas as células da amostra, causando lise celular durante o descongelamento ou durante o isolamento do cfDNA. Para adquirir os melhores resultados, uma segunda etapa curta, mas de alta velocidade, deve ser adicionada ao protocolo. Ao estudar amostras de urina com conservante, protocolos de centrifugação curtos e de baixa velocidade em uma etapa resultaram nas maiores concentrações de DNA total (Fig. 9A). Infelizmente, os resultados do FragmentAnalyzer indicam que todos os protocolos de centrifugação ainda produzem uma grande quantidade de gDNA em todas as amostras testadas (Fig. 9B). Embora as diferenças não sejam significativas, nossos resultados sugerem usar o protocolo de centrifugação 750g 10min 2.680g 10min para amostras de urina fresca e 4.000g 10min ou 3.000g 15min quando o conservante Streck é adicionado à amostra. Os tampões foram escolhidos devido ao seu baixo custo, ampla disponibilidade e uso rotineiro em laboratórios clínicos, bem como à sua natureza isotônica com células bacterianas, o que limitaria qualquer lise celular e perda de DNA.

Extração De DNA De Um Teste De Urina



No entanto, até onde sabemos, ainda não existem estudos comparando kits comerciais de extração de DNA humano atualmente disponíveis no mercado com foco em estudos epidemiológicos e de saúde pública em larga escala. A análise da expressão gênica baseada em amostras de urina é particularmente

  • Os padrões de plasmídeo do gene 16S rRNA de E.
  • Coli com primers (47F 5ʹ-GAACGGTAACAGGAAKCAGCT-3ʹ e 194R 5ʹ- ATCCGATGGCAAGAGGCC -3ʹ) e sonda de hidrólise (5′-FAM-CGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGG-TAMRA -3′).
  • Os rendimentos gerais e específicos de DNA de amostras de urina padronizadas demonstraram que a abundância microbiana diferiu significativamente entre os oito métodos utilizados.
  • Jensenii foram submetidas à extracção de ADN na ausência de urina.


Uma limitação importante é que não realizamos PCR de amplicon de amplo alcance e sequenciamento profundo em amostras correspondentes para determinar se a representação geral da comunidade bacteriana é melhorada com a adição de tampão Tris-EDTA. Portanto, não podemos concluir que esta abordagem irá melhorar o rendimento de todas as bactérias presentes na urina. Outra limitação deste teste foi que comparamos as eficiências em apenas quatro amostras de urina porque a urina foi coletada principalmente para questões relacionadas à microbiota e NGU, restringindo as amostras disponíveis para otimização da extração de DNA. Apesar do número limitado de amostras testadas quanto à eficiência de extração, mostramos concentrações aumentadas de DNA isolado bacteriano em cada uma das quatro amostras tratadas com Tris-EDTA em comparação com amostras que não foram tratadas.

Citologia De Urina



Esta diminuição depende diretamente da concentração de fosfato, como pode ser visto nos gráficos do logaritmo da concentração de fosfato em relação ao logaritmo dos rendimentos de DNA fúngico (C) e bacteriano (D). As amostras utilizadas como corpos de prova ao longo deste artigo foram anuladas. A contaminação de locais próximos, como pele, uretra e vagina (em mulheres), pode contribuir fortemente para o conteúdo microbiano das amostras anuladas[44]. Quando comparados diretamente (Fig. 3), os níveis de fungos nas amostras de mulheres foram 2 a 3 vezes maiores do que os observados em homens.

  • [11,14], dificultando a recuperação quantitativa após esse período
  • Quando comparados diretamente (Fig. 3), os níveis de fungos nas amostras de mulheres foram 2 a 3 vezes maiores do que os observados em homens.
  • Este relatório descreve um protocolo otimizado para a análise de fungos urinários que também é altamente eficaz para a análise simultânea de populações bacterianas urinárias.


Embora isto possa refletir uma diferença no conteúdo fúngico urinário entre os sexos, que pode ser um produto da anatomia diferente do trato urinário inferior entre os sexos, também pode refletir apenas diferenças na contaminação de locais urogenitais próximos. Como resultado, este artigo não procura tirar conclusões sobre a composição do micobioma urinário, mas sim explorar as soluções necessárias para caracterizar o conteúdo microbiano das amostras de urina. Serão necessários estudos em maior escala, atualmente em andamento, utilizando uma infinidade de amostras para explorar o micobioma urinário. Acredita-se que o volume da amostra influencie a representação da complexidade microbiana determinada pelo NGS, particularmente em amostras de baixa biomassa, como a urina [44], o que também foi sugerido pelos nossos resultados preliminares (Fig. 1C). Para determinar a magnitude do efeito do volume da amostra na produção microbiana e na profundidade e diversidade da comunidade, examinamos os perfis microbianos em uma variedade de volumes de amostras de urina.

Quão Preciso É Um Teste De Citologia De Urina?



As amostras foram armazenadas a -80°C até o uso. As condições individuais observadas para aumentar os rendimentos foram testadas em conjunto em um painel de otimização em maior escala.

  • O conservante UCM e Streck, por outro lado, produziram uma alta concentração de DNA total (adequado para ddPCR) (Fig. 5A), enquanto apenas Streck também preservou uma alta proporção de cfDNA (Fig. 5B).
  • A extração de DNA de urina fresca já foi descrita anteriormente, produzindo DNA utilizável para análise de PCR em até 35% dos homens saudáveis ​​e até 75% das mulheres saudáveis
  • Alterações na metodologia de armazenamento, preparação e processamento de DNA da urina melhoram o perfil da comunidade microbiana usando métodos de sequenciamento independentes de cultura.
  • Primers foram adicionados a 0,8 μM por reação e sonda a 150 nM por reação.
  • No entanto, apresenta diversas limitações, como a necessidade de um
  • A 4°C, homogeneizado e centrifugado a 1300g por


Biotek Corp) para extração de ácido nucleico, e o excedente de urina foi Imediatamente aliquotadas sem centrifugação e congeladas a −80°C em tubos Falcon para posterior extração de proteínas.

Materiais



Nosso protocolo otimizado conforme definido nem sempre foi o mais eficaz para todos os sujeitos avaliados. As maiores variações ocorreram com as condições de centrifugação; é provável que, para indivíduos com menor teor de sal urinário, haja melhores resultados com velocidades de centrifugação mais elevadas.

  • Embora este estudo tenha sido um estudo piloto e precise ser confirmado em uma população de estudo maior, foram observadas tendências claras no efeito de várias condições pré-analíticas.
  • Foi necessário coletar amostras de urina do jato médio e
  • As demais alíquotas não foram tratadas com Tris-EDTA.
  • Por esse motivo, freezers a -20°C são mais utilizados para armazenamento de amostras.
  • A remoção do inibidor de PCR é crucial, pois os inibidores de PCR podem levar à falha da PCR e a resultados falso-negativos.

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